【NIR-II近红外二区成像】近红外二区小动物成像-荧光与化疗融合探针的进展(精品国产一区二区三区AV蜜桃)

摘要

将诊断与治疗功能结合为一体是当前应对癌症的一种新兴策略. 诊疗一体化作为一种潜在的新型医学诊治方式, 在快速获得体内信息、 改善生物分布、 减少剂量和降低毒副作用等方面具有潜在的应用前景. 荧光成像被广泛应用于医学诊断, 近年来近红外荧光成像技术得到飞速发展, 在活体成像方面具有较好的穿透深度和成像分辨率. 本文综合评述了部分整合荧光成像和化疗的有机单分子诊疗试剂的相关研究, 并对诊疗一体化探针的未来研究进行了展望.

关键词： 诊疗一体化探针 ; 近红外荧光成像 ; 化疗

Abstract

Combining diagnostic and therapeutic functions is an emerging strategy to treat diseases such as cancer. As a promising novel medical regimen， the integration of diagnosis and treatment has potential functions in rapidly obtaining in vivo information， improving biodistribution， reducing dosage， and reducing toxic and side effects. Especially， fluorescence imaging has been widely used in pre-clinical and clinical medical research. In recent years， near-infrared fluorescence imaging has progressed rapidly with improved penetration depth and imaging resolution for in vivo imaging. In this review， we summarized some recent researches on single-molecule based theranostic agents integrating fluorescence imaging and chemotherapy， and foresaw future research on theranostic probes.

Keywords： Theranostic probe ; Near infrared fluorescence imaging ; Chemotherapy

当今， 癌症仍然是一种严重威胁人类健康的高发病率和高致死率的恶性疾病. 根据GLOBOCAN 2020年的报告， 预测2040年全球癌症的患者数量将达到2840万例， 相比于2020年将会增长47%. 同时， 在全球112个国家中， 癌症是这些国家70岁以下人口死亡的第一或第二主要原因［1］. 对于早期实体瘤， 手术切除是治疗癌症的首选措施， 但是手术切除受限于癌症的种类、 位置、 分期以及其它潜在的疾病. 如， 在西方国家95%的肝癌患者通常合并潜在的肝硬化， 手术切除后往往存在肝功能衰竭的风险［2］. 化疗是治疗癌症的另外一种主要方式， 尤其对于晚期癌症患者. 传统的化疗药物包括具有细胞毒性的抗生素（如阿霉素和丝裂霉素）、 烷化试剂（氮芥类、 顺铂和环磷酰胺）、 抗代谢类（氟尿嘧啶、 吉西他滨和甲氨蝶呤）、 微管蛋白抑制剂（长春新碱和紫杉醇）和拓扑异构酶Ⅰ抑制剂（喜树碱和伊立替康）等. 然而传统化疗通常需要多次剂量才能有效， 导致治疗过程中日益严重的全身毒性和耐药性， 同时很多肿瘤化疗的疗效也受到药物在肿瘤中积累能力的限制［3］. 为了解决这些问题， 大量的研究集中在开发更有效且更有选择性的抗癌药物上， 同时也积极研究新的治疗策略.

疾病的诊断作为现代医学不可或缺的一部分， 在帮助医生快速对疾病做出治疗决策方面发挥着重要作用. 早期诊断且发现癌症将有利于延长5年生存期， 甚至完全治愈癌症［4］. 如何在癌症早期精准诊断并发现肿瘤微病灶成为当今医学发展极为迫切的需求点［5］. 诊疗一体化是指将诊断与治疗功能结合为一体， 是当前应对癌症的一种新兴的策略［6］. 当前常见的诊断方式包括计算机断层扫描（Computed tomography， CT）、 核磁共振成像（Magnetic resonance imaging， MRI）、 正电子发射断层扫描（Positron emission tomography， PET）与单光子发射计算机断层扫描（Single photon emission computed tomography， SPECT）、 超声成像（Ultrasound， US）以及光学成像（Optical imaging， OI）.

光学活体成像利用波长位于400~1700 nm波段的光实现了对多种疾病的体内生物成像. 近年来， 研究人员发现波长比可见光更长的近红外光（NIR， 700~1700 nm）在生物组织上可以实现更高分辨率、 更大穿透深度的成像. 近红外成像又分为近红外一区（NIR-Ⅰ， 700~900 nm）和近红外二区（NIR-Ⅱ， 1000~1700 nm）成像. 与传统的近红外一区相比， 近红外二区成像质量更好， 能提供更高的信噪比和更深的穿透深度［7~10］. 光学成像， 尤其是NIR-Ⅱ成像技术避免了CT， PET及SPECT存在电磁辐射的问题， 同时具有微米级别的分辨率， 展现出良好的生物医学应用前景. 同时， 化学、 材料科学和纳米技术的快速发展也帮助科学家开发出不同种类的近红外探针， 包括量子点、 稀土掺杂纳米粒子、 碳纳米管、 有机小分子以及有机共轭聚合物类［11~17］. 其中， 稀土掺杂纳米材料相比于有机探针光稳定性更好， 不过其长期滞留体内带来的潜在毒性阻碍了进一步的临床转化和应用； 同时， 单壁碳纳米管的荧光量子产率较低， 不能很好地从体内代谢； 而通过调节量子点的粒径大小和形状可以调控其在体内的药代动力学和组织分布， 因此研发超小量子点纳米晶体使其低于肾脏代谢阈值（≈40000）具有重要意义， 然而减小纳米尺寸又会降低量子产率， 如何平衡好各方面是一个具有挑战性的难题［18，19］. 鉴于以上问题， 有机荧光探针具有分子量小、 可快速代谢、 可修饰性高、 生物相容性高和明确的分子骨架等优点而成为生物成像领域的研究重点. 相比上述无机纳米材料的种种缺点， 有机荧光分子更有希望被推向临床应用.

目前， 常见的诊疗探针大体分为两类： 第一类通过一个纳米平台将目前常用的抗肿瘤药物及具有诊断作用的探针整合或包载在一起. 常见的药物包括喜树碱、 阿霉素和紫杉醇等， 常见的诊断试剂包括荧光分子试剂、 核磁造影剂及放射性核素成像试剂等. 通过在纳米表面修饰靶向配体可获得主动靶向肿瘤的能力， 或者通过调节纳米颗粒的尺寸依赖增强渗透滞留效应（Enhanced permeability retention effect）被动靶向. 但是纳米颗粒质控艰难、 制备复杂且生物相容性差， 在药代动力学体内行为及纳米颗粒释放药物的实时监测方面仍存在很多亟待解决的问题， 向临床转化的难度相比有机小分子更高. 第二类属于有机小分子偶联诊疗探针. 通过共价键如二硫键、 酯键等将药物分子与诊断试剂偶联， 这些诊疗探针到达病灶部位后在刺激响应下， 药物与荧光试剂之间连接的共价键断开， 分别实现治疗和成像的功能. 本文将对近年来报道的一些有代表性的基于荧光成像整合化疗的有机小分子诊疗探针的研发和应用进行综合评述（Scheme 1）， 并根据荧光成像发射波长的范围， 分别对可见光、 近红外一区和近红外二区有机小分子偶联诊疗探针进行了叙述和探讨.

1 有机小分子诊疗探针

1.1　可见光有机小分子诊疗探针

2011年， Perez等［20］开发了一类可见光有机单分子偶联诊疗探针， 将抗癌药物阿霉素（Dox， 发射 波长： 594 nm）与叶酸（FR）通过二硫键（—S—S—）偶联， 构建了可发射荧光和可激活细胞毒性的靶 向诊疗探针Doxo-S-S-Fol［图1（A）］. 当阿霉素与叶酸通过二硫键偶联时， 阿霉素的荧光和细胞毒性均被猝灭（OFF）. 谷胱甘肽（GSH）作为一种还原型三肽， 通过控制各种细胞内过程如细胞分化、 细胞代谢、 氧化应激和化疗期间的抗氧化及细胞凋亡， 在保护细胞方面发挥重要作用［21］. 当叶酸靶向到肿瘤部位时， 在GSH存在下可以将二硫键断开， 阿霉素的荧光被激活（ON）. 作者同时还设计了以碳碳键（—C—C—）连接阿霉素和叶酸的对比探针， 在GSH存在下其荧光没有明显改变， 说明二硫键能够有效被GSH断开. 如图1（B）所示， 体外细胞实验证实Doxo-S-S-Fol具有较高的细胞摄取， 同时观察到FR过表达A549细胞成像的荧光强度随着时间增加而增强， 在12 h时达到高峰. 随后Dox诱导细胞死亡， 荧光强度逐渐下降［图1（B）］. GSH诱导激活的Doxo-S-S-Fol在48 h内杀死近90%的癌细胞， 而对照探针Doxo-C-C-Fol只引起5%的细胞死亡. 与单一阿霉素（IC50=20.3 µmol/L）相比， Doxo-S-S-Fol的IC50值达到1.27 µmol/L， 表明Doxo-S-S-Fol作为前药是一个对癌症细胞成像与治疗都有效的诊疗探针.

Fig.1 Structures of Doxo⁃S⁃S⁃Fol and Doxo⁃C⁃C⁃Fol(A) and f

Fig.1 Structures of Doxo⁃S⁃S⁃Fol and Doxo⁃C⁃C⁃Fol(A) and fluorescence microscopy images of A549 cells stained by Doxo⁃S⁃S⁃Fol at different intervals(B)[20]

二氰基亚甲基-4H-吡喃衍生物（Dicyanomethylene-4H-pyran， DCM）作为经典的给体-π-受体类荧光单元， 因其超快的内部电荷转移而表现出宽的吸收带［22~26］. 基于DCM衍生物开发荧光探针在近些年来受到广泛关注， 通过调节电子受体， DCM衍生物的发射波长甚至可以延长至近红外区， 同时具有大的斯托克斯位移及高的光稳定性等特点［27~29］. 2014年， Zhu等［30］开发了一类GSH激活的单分子诊疗探针DCM-S-CPT. 该探针以DCM作为荧光单元， 通过二硫键与抗癌药物喜树碱（Camptothecin， CPT）偶联， 如图2（A）所示， 在GSH存在下二硫键断开， CPT被释放出来， DCM的氨基作为给电子基团游离出来， 从而激活DCM的荧光， 其发射峰位于665 nm. 作者将二硫键替换为碳碳键合成了DCM-C-CPT作为对照， 体外细胞实验证明DCM-S-CPT对BCap-37， HepG2， MCF-7， HeLa， KB和KB-200等细胞系的活性比单一的CPT更高， 比DCM-C-CPT的高约2倍. 为了评估DCM-S-CPT的成像功能， 分别将DCM-S-CPT和DCM-C-CPT通过尾静脉注射入小鼠体内. 由图2（B）和（D）可见， 注射DCM-S-CPT约9 min后， 小鼠身上便有了荧光信号， 说明药物已经开始在体内释放； 而DCM-C-CPT组的荧光信号很弱. 更重要的是， 体外分布实验证明DCM-S-CPT可以在肿瘤中释放更多的药物［图2（C）和（E）］. 为了验证体内肿瘤治疗效果， 作者将DCM-S-CPT用聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）包载形成胶束， 并且与CPT组、 DCM-C-CPT组及对照组（PBS）进行对比， 结果显示DCM-S-CPT对BCap-37荷瘤鼠的治疗效果最佳， 充分证实了DCM-S-CPT作为诊疗探针的巨大潜力.

Fig.2 Activation principle and imaging property of DCM⁃S⁃C

Fig.2 Activation principle and imaging property of DCM⁃S⁃CPT[30]

（A） Reaction mechanism of DCM-S-CPT breaking disulfide bond under GSH； （B） in vivo fluorescence imaging of tumor-bearing mice at various time after intravenous injection of DCM-C-CPT； （C） fluorescence imaging of in vivo biodistribution of DCM-C-CPT； （D） in vivo fluorescence imaging of tumor-bearing mice at various time after intravenous injection of DCM-S-CPT； （E） fluorescence imaging of in vivo biodistribution of DCM-S-CPT. Copyright 2014， American Chemical Society.

2017年， Wu等［31］以DCM作为荧光基团， 以CPT作为抗癌药物， 开发了以GSH触发式自降解树枝状单元双边偶联DCM和CPT的前药CPT-DNS-DCM， 其中DCM荧光团的初始荧光几乎完全被吸电子触发式自降解单元猝灭. 在大量GSH存在的情况下（图3）， 经过1，4-消除反应， 活性的CPT和DCM被释放， 在单光子或双光子激发下HeLa细胞内可观察到明显的荧光， 表明CPT-DNS-DCM可以有效在细胞内释放药物， 测得其对HeLa细胞系的IC50值为5.8 µmol/L. 该前药还用于体内跟踪荷瘤小鼠的药物释放， 在给药4 h后便可以观察到肿瘤部位的荧光， 表明药物开始释放， 注射24 h后肿瘤部位的荧光依旧很强. 此外， CPT-DNS-DCM脂质体在原位抗肿瘤试验中表现出对肿瘤生长的高度抑制作用.

Fig.3 Activation principle of CPT⁃DNS⁃DCM

Fig.3 Activation principle of CPT⁃DNS⁃DCM

萘二甲酰亚胺因其独特的分子内电荷转移特性和高的量子产率而被认为是一种有较大价值的荧光报告基团［32~34］. 2012年， Kim等［35］报道了一个基于萘二甲酰亚胺荧光团的可见光诊疗探针. 如图4中化合物1所示， 通过二硫键将荧光基团萘二甲酰亚胺（红色部分）与抗癌药物喜树碱偶联； 同时， 萘二甲酰亚胺的N上连接了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）环肽用于靶向U78肿瘤细胞过表达的αvβ3受体， 在肿瘤的GSH催化下二硫键断开， 荧光团和药物分别被释放， 其中萘二甲酰亚胺可以发射535 nm的光. 作者通过细胞成像验证了化合物1在U78细胞内可以有效断开二硫键并释放药物， 测得其48 h的IC50值为1 µmol/L. 2014年， 该课题组［36］通过将RGD更改为生物素作为定向基团， 同时将抗癌药物喜树碱更改为多肽药物Holiday Junction（HJ）抑制剂， 设计合成了化合物3（图4）. HJ是在DNA损伤的同源重组修复过程中形成的一种短暂的4链DNA结构， 而HJ多肽抑制剂可以与HJ相互作用从而发挥抗癌活性. 化合物3可通过生物素靶向至HepG2细胞并释放HJ多肽抑制剂， 同时细胞内荧光增强. 通过荧光强度实时监测药物的释放量， 从而为其它多肽类药物的开发提供了一种策略， 也为诊疗药物的开发 提供了思路. 2013年， Zhou等［37］将氮芥类药物与萘二甲酰亚胺通过二硫键相偶联， 合成了化合物2 （图4）. 体外光学性质测定发现， 化合物2的二硫键断开前的发射波长为475 nm， 滴加二巯基苏糖醇后二硫键断开， 其发射波长红移至533 nm. 采用HeLa癌细胞测得其IC50值为（28.8±0.8） µmol/L， 同时通过细胞成像观察到细胞荧光从蓝色［蓝色通道： （450±35） nm］逐渐变为绿色［绿色通道： （515±30） nm］， 从而证明在细胞内化合物2的二硫键断开， 药物被释放， 同时萘二甲酰亚胺的荧光发生变化.

Fig.4 Organic theranostic probes based on naphthalimide fl

Fig.4 Organic theranostic probes based on naphthalimide fluorophore

线粒体是细胞的能量工厂， 在各种生物过程中发挥着重要作用， 众多氧化还原反应在这些细胞器内进行［38］. 在癌细胞内， 线粒体具有更高的膜电位. 三苯基膦（TPP）由于亲脂阳离子的特性从而可以靶向线粒体， 因此常作为靶向线粒体的分子单元与其它药物偶联. F16小分子是一种新的亲脂阳离子， 既能作为荧光团， 又具有杀伤癌细胞的活力， 同时作为离域阳离子化合物可以靶向癌细胞的线粒体， 引发癌细胞的细胞凋亡和坏死［39，40］. 2014年， Cheng［41］等将TPP与F16衍生物偶联， 研发了可见光有机诊疗探针F16-TPP， FF16-TPP和MeF16-TPP［图5（A）］. 该类化合物具有双靶向线粒体的离域阳 离子基团， 发射波长位于525 nm. 在U84MG和MDA-MB-231两个细胞系上分别进行细胞摄取实验和细胞荧光成像实验， 结果显示这些化合物均可以很好地分布在癌细胞线粒体内. 其中， 相比于U87MG细胞系， FF16-TPP在MDA-MB-231细胞系中具有更高的摄取量， 在这些化合物中， MeF16-TPP具有最优异的癌细胞摄取能力. 在U87MG细胞系上测得F16-TPP， FF-16-TPP和MeF16-TPP的IC50值分别为 >200， （28.9±1.1）和（64.0±1.3） µmol/L， 氟原子的引入显著提高了细胞活性. 2019年， Cheng等［42］继续改进该类化合物， 合成出一系列F16的衍生物， 其中5BMF显示出最好的细胞活性， 其IC50达到约 50 nmol/L， 对癌细胞的选择性是正常细胞的225倍［图5（A）］. 体外细胞成像结果显示， 该化合物可以在3T3， H838和T24等细胞系的线粒体内积累， 与商业化线粒体示踪探针MitoTracker Red成像重合度非常高［图5（B）， Pearson相关系数分别为0.978， 0.924和0.929］. 因此， 将该化合物用于荷瘤鼠的体内研究. 以15 mg/kg的剂量静脉注射5BMF， 2 h后HCC827荷瘤鼠的肿瘤部位出现荧光［图5（C）］， 肿瘤与周围正常组织的荧光比值为2. 肿瘤治疗实验显示， 5BMF具有强效的抑制肿瘤生长的能力， 表明5BMF作为有机小分子诊疗探针的较好潜力.

Fig.5 Structures and imaging property of F16 derivatives[4

Fig.5 Structures and imaging property of F16 derivatives[42]

（A） Structures of F16 derivatives； （B） fluorescence imaging of mitochondrial co-localization of 5BMF in different cell lines； （C） fluorescence imaging of tumor-bearing mice after intravenous injection of 5BMF for 2 h. Copyright 2019， the Royal Society of Chemistry.

1.2　近红外一区有机小分子诊疗探针

花菁染料作为经典的近红外荧光染料， 广泛用于动物血管、 肿瘤以及淋巴结成像. 其中， 吲哚菁绿（ICG）是目前唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的花菁染料， 用于人体肝脏疾病的诊断. 基于花菁染料结构设计诊疗探针是一个很有前景的方向. 2013年， Yang等［43］开发了一系列通过氨基甲酸乙二硫基连接花菁染料和抗癌药物吉西他滨的诊疗探针， 同时连接叶酸作为靶向基团［图6（A）］. 当在含有0.2 mmol/L的GSH溶液中孵育时， 该诊疗探针在735 nm处的荧光增强了42倍， 通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）进一步证实了GSH可以有效断开二硫键， 并释放药物吉西他滨. 作者选取叶酸受体表达阳性的KB细胞和叶酸受体表达阴性的A549细胞进行了细胞荧光成像实验， 结果显示只有在KB细胞中观察到红色荧光， 说明探针进入到KB细胞并成功释放药物［图6（B）］. 此外， 建立了KB皮下瘤小鼠模型和A549皮下瘤小鼠模型， 将Cy7通过静脉注射入小鼠体内， 24 h后将肿瘤摘除并切成7 µm厚的薄片， 随后进行荧光成像. 只有在KB皮下瘤实验组观察到了红色荧光， 而A549皮下瘤实验组未观察到， 表明Cy7具有靶向肿瘤叶酸受体的特异性.

Fig.6 Structure and imaging property of Cy7[43]

Fig.6 Structure and imaging property of Cy7[43]

（A） Structure of organic theranostic probe Cy7； （B） fluorescent images of KB and A549 cells treatedwith Cy7 at various time（0， 5， 10 and 20 min）. Copyright 2013， American Chemical Society.

IR-780碘化物是一种近红外荧光染料， 其在肿瘤细胞的线粒体中表现出特异积累的特性. 2014年， Shi等［44］研究了IR-780靶向肿瘤细胞的可能机制及其作为药物递送载体的潜力， 发现IR-780碘化物进入肿瘤细胞线粒体属于能量依赖的主动转运， 肿瘤细胞对其摄取受糖酵解和线粒体膜电位的影响. 此外， OATP1B3亚型有机阴离子转运肽（OATPs）可能在IR-780碘化物转运到肿瘤细胞中起主导作用， 而细胞内吞作用、 线粒体膜电位和ATP结合盒转运蛋白对其没有显著影响. 作者将IR-780与氮芥偶联得到IR-780NM， 动物肿瘤成像显示出IR-780NM具有肿瘤靶向特性， 表明IR-780碘化物可潜在地用作癌症靶向成像和治疗药物的递送， 为有机诊疗探针的设计提供载体. 脑肿瘤以及脑肿瘤转移是一类预后极差、 患者生存期极短的致命性疾病， 由于脑肿瘤对化疗和放疗具有较高耐受性， 因此通过成像发现肿瘤并早期手术干预脑肿瘤是一线标准治疗［45，46］. 研发对脑肿瘤检测与治疗的诊疗探针的核心挑战是将诊疗药物有效输送至肿瘤部位， 而血脑屏障是大多数药物从体循环输送至脑肿瘤组织的主要障碍. 为解决这个问题， Wu等［47］基于近红外花菁染料开发了用于原发性脑肿瘤成像和治疗的诊疗探针NIRG. 该探针将IR783与抗癌药物吉西他滨偶联， 前期研究证实IR783可以通过缺氧诱导因子1α（HIF1α）和有机阴离子通道（OATPs）信号轴优先靶向肿瘤细胞［48］. 为了验证NIRG是否可以通过血脑屏障到达脑肿瘤， 构建了小鼠颅内U87异种移植瘤， 每只小鼠给药后1 h便可以观察到近红外荧光. 这说明NIRG能够穿透血脑屏障靶向脑肿瘤， 在24 h荧光强度达到最大； 与无肿瘤对照组相比， 不同时间点的信号背景比值在3.5~4.2之间. 体外分布实验表明， 脑肿瘤荧光强度是脾脏的7.9倍. NIRG显著抑制了小鼠颅内U87肿瘤的生长， 而且小鼠的体重未受影响， 表明NIRG是一个有效的有机诊疗探针. Shih等［49］将单胺氧化酶A（MAOA）抑制剂 Clorgyline与花菁染料通过共价键偶联， 得到有机诊疗药物NMI［图7（A）］. 作者构建了人前列腺癌细胞C4-2B皮下瘤小鼠模型， 通过定期瘤内注射NMI， 考察了NMI对肿瘤的治疗作用. 在给药后通过近红外成像发现， NMI可以蓄积在肿瘤部位［图7（B）］， 在整个治疗期间NMI组小鼠的肿瘤生长明显被抑制［图7（C）］.

Fig.7 Theranostic property of cyanine based probes[49]

Fig.7 Theranostic property of cyanine based probes[49]

（A） Structures of organic theranostic probes of IR-780NM， NIRG and NMI； （B） near-infrared fluorescence imaging of the mice after intratumoral injection of NMI； （C） the tumor size variation curve of the NMI-treated group and the normal saline group. Copyright 2015， American Chemical Society.

2016年， Ye等［50］基于花菁染料推拉电子结构的改变会导致发射波长变化的原理， 设计了一类新型有机诊疗探针Cy-S-CPT. 该探针通过二硫键将花菁染料与喜树碱偶联， 在GSH的催化下通过二硫键断开和分子内环合2步， 释放游离的CyA-K和CPT［图8（A）］. 其中， 荧光团的发射波长由于π共轭体系被减弱， 从825 nm蓝移至650 nm， 从而允许双通道双色检测探针在动物体内的分布. 采用Cy-S-CPT在人乳腺癌细胞BCap-37和正常细胞MDCK进行了细胞活性实验， 同时以碳碳键偶联花菁染料和喜树碱的探针Cy-C-CPT作为对照， 结果测得Cy-S-CPT的IC50值为1.7 µmol/L， Cy-C-CPT的则为11.3 µmol/L. 由于对正常细胞也具有毒性， 作者采用PEG-PLA包载形成纳米粒从而增大在肿瘤中的摄取. 如 图8（B）~（D）所示， 对小鼠通过尾静脉注射了PEG-PLA/Cy-S-CPT， PEG-PLA/Cy-C-CPT及PEG-PLA/ CyA-K， 选取825 nm通道（绿色）观察探针在全身的生物分布， 选取650 nm通道观察药物的释放情况， 两种通道的叠加（黄色）表明同时存在原始探针与游离的探针. 注射4 h后， 由于Cy-S-CPT逐渐被激活， 绿色信号逐渐减弱， 红色信号逐渐增强， 注射24 h后肿瘤部位的信号比Cy-C-CPT更高， 说明药物被有效释放， 也表明了Cy-S-CPT探针的优异性能. 在治疗方面， BCap-37皮下瘤小鼠模型被随机分组并静脉注射PEG-PLA/Cy-S-CPT、 伊立替康（CPT-11）和PBS， 治疗周期结束后， 测得PEG-PLA/Cy-S-CPT组的肿瘤抑制率达到94.0%， 而CPT-11组则仅为55.8%， 说明纳米粒子渗透肿瘤以及二硫键断开能够更有效地发挥抗肿瘤活性. 基于同样的思路， Guo等［51］设计合成了Cy-CPT-Biotin（图9）， 其发射波长为810 nm， 该探针通过氨基甲酸酯与喜树碱偶联， 同时通过点击反应与靶向配体生物素相连接. 在680 nm（20 mW/cm2）光激发下， 与花菁中心环相连的碳碳双键发生断裂， 随后连接喜树碱的乙二氨基片段在生理条件下会发生分子内环化反应从而自我消除， 释放游离的喜树碱， 新生成的Cy-Biotin的发射波长蓝移至535 nm. 体外和体内研究均表明Cy-CPT-Biotin具有良好的肿瘤靶向能力和光激发依赖的细胞毒性. 该类体外光激活释药的诊疗探针具有双通道荧光成像跟踪药物行为、 优秀的肿瘤靶向能力及利用光激活药物释放的时空控制等优势， 从而能够精确和有效地调整药物在何处、 何时及如何被递送.

Fig.8 Activation principle of Cy⁃S⁃CPT and imaging propert

Fig.8 Activation principle of Cy⁃S⁃CPT and imaging property of Cy⁃S⁃CPT, Cy⁃C⁃CPT and CyA⁃K[50]

（A） Proposed mechanism of Cy-S-CPT activated by GSH； （B—D） in vivo bioimaging of tumor-bearing mice at various time（0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8 and 24 h） after intravenous injection of PEG-PLA/Cy-S-CPT（B）， PEG-PLA/Cy-C-CPT（C） and PEG-PLA/CyA-K（D） at a dose of 5 µmol/kg. Copyright 2016， the Royal Society of Chemistry.

Fig.9 Structure of Cy⁃CPT⁃Biotin

Fig.9 Structure of Cy⁃CPT⁃Biotin

联合2种及以上的疗法将会提高治疗癌症的疗效. Liu等［52］报道了一个线粒体靶向、 过氧化氢（H2O2）激活的近红外一区有机诊疗探针， 可实现近红外荧光成像引导的化疗-光动力（PDT）联合治疗. 由图10（A）可见， 利用频哪醇与苯硼酸之间形成的硼酸酯键可以在H2O2存在下断开， 选择了含有频哪醇的抗癌前药脱氧氟尿苷， 同时在荧光团NPS上引入苯硼酸结构， 最终得到PNPS. 由于PNPS的羟基被取代， 因此其近红外荧光和PDT效应被抑制. NPS的荧光发射波长位于710 nm， 体外细胞实验证明， 无光照条件下， 不与药物偶联的NPS-H2O2和脱氧氟尿苷与HeLa和HepG2细胞孵育3 h后， 仍有超过80%的细胞存活， 而PNPS对HeLa和HepG2细胞的IC50值分别为16.6和14.8 µmol/L， 说明PNPS单独化疗效果优于脱氧氟尿苷， 而在白光照射下， PNPS对HeLa和HepG2细胞的IC50分别达到9.32和8.15 µmol/L. 作者在HCT116肿瘤鼠上进行了近红外成像实验， 如图10（B）所示， 尾静脉注射PNPS后1 h在肿瘤部位开始有荧光， 说明药物开始释放， 随后的12 h内荧光强度随着时间的增加而增强. 这些实验结果证明PNPS是一种高效的可靶向肿瘤的诊疗探针.

Fig.10 Structure and imaging property of PNPS[52]

Fig.10 Structure and imaging property of PNPS[52]

（A） The design of PNPS and proposed activation mechanism； （B） in vivo near-infrared fluorescence imaging of HCT116 tumor-bearing mice at different time（0， 1， 3， 6， 12 and 24 h） after intravenous injection of PNPS at the dose of 4.31 mg/kg. Copyright 2017， the Royal Society of Chemistry.

1.3　近红外二区有机小分子诊疗探针

将荧光成像窗口转移至近红外二区有利于提高成像分辨率、 减少自体荧光和增大穿透深度， 因此开发基于近红外二区成像的诊疗一体化探针非常有前景. 目前， 已经报道的整合近红外二区成像与化疗功能于一体的有机单分子诊疗探针依旧很少. 2021年， Zheng等［53］报道了一个近红外二区有机小分子诊疗探针H4-PEG-Glu［图11（A）］， 该探针具有线粒体靶向的能力， 连接的PEG-Glu极大提高了该探针的水溶性. 该探针不仅具有化疗的作用， 还能够产生光热效应， 同时该探针的主发射波长位于1085 nm， 还有一个肩峰位于1200 nm. 体外细胞实验证实， 无激光照射下H4-PEG-Glu对急性髓性白血病细胞THP-1和Molm-13的IC50值分别为（23.97±3.24）和（29.66±1.09） µmol/L， 测得H4-PEG-Glu的光热转化效率为11.6%. 作者建立了急性髓性白血病小鼠模型， 考察了H4-PEG-Glu的成像和治疗效果. 如 图11（B）所示， 尾静脉注射3 h后便可以在骨髓处观察到荧光信号， 在对照组中无法观察到此现象. 随后的治疗实验表明， H4-PEG-Glu光热协同化疗可以有效减少CD34+细胞的含量， 同时生物安全性实验未发现该探针对肝脏和肾脏功能的抑制， 说明H4-PEG-Glu是一个相对有效而且安全的近红外二区有机小分子诊疗探针. 2022年， Cheng等［54］报道了一类基于Donor-Acceptor-Donor（D-A-D）电子结构的有机小分子诊疗探针. 受氮芥类药物对癌细胞毒性随着孵育温度升高而增加的启发， 作者将氮芥药物的活性片段双-（二氯乙基）氨基引入到D-A-D类小分子的三苯胺受体上， 从而得到整合近红外二区荧光、 光热与化疗一体化的有机小分子诊疗探针， 为未来有机小分子诊疗探针的设计提供了参考．

Fig.11 Synthetic route and imaging property of H4⁃PEG⁃Glu[

Fig.11 Synthetic route and imaging property of H4⁃PEG⁃Glu[53]

（A） Synthetic route of H4-PEG-Glu； （B） in vivo near-infrared second-region fluorescence imaging of acute myeloid leukemia PDX mice and normal mice at different times（3， 6 and 9 h） after intravenous injection of H4-PEG-Glu respectively. Reproduced from Ref.［53］ with permission from the Royal Society of Chemistry.

2 现有挑战与远景

由于个体差异的存在， 癌症治疗标准化方案对不同患者产生的疗效也有很大差别， 因此个性化医疗成为趋势. 诊疗一体化正是通过将诊断与治疗有机结合， 从而对不同患者在治疗过程中能够实时监测疾病的变化情况， 并对治疗方案做出适当改变. 诊疗探针的研发是发展诊疗一体化的关键环节， 目前已经有基于核素成像和治疗的诊疗探针、 基于MRI的诊疗探针和基于荧光成像的诊疗探针被报道. 相较于PET/SPECT和MRI， 基于荧光成像的诊疗探针具有如下优势： （1） 相较于MRI需要长时间扫描的特性， 荧光成像具有灵敏度高的优势， 尤其是近红外二区成像的时间和空间分辨率较好； （2） PET/SPECT成像具有放射性， 且基于PET成像的探针适合标记的核素的半衰期通常较短（如18F， 110 min）， 不利于长时间检测药物在肿瘤或者靶标部位的分布情况； 而荧光成像不具有放射性和衰减特性， 在长时间检测药物分布方面具有优势； （3） 开发生物小分子响应型荧光分子能够动态监测生理反应， 如开发ATP， GSH， H2O2以及pH等智能响应型荧光诊疗探针. 这有利于反馈疾病的变化情况， 对治疗效果进行实时评估并及时调整治疗方案.

基于荧光成像的诊疗探针除了具有上述优势， 还具有如下缺陷： （1） 荧光成像穿透深度较小， 对于深层组织成像不佳. 尽管近红外二区成像深度得到了极大提高， 穿透深度依旧有限， 大多数研究也仅停留在小鼠成像的研究阶段. 而研发发射波长更长的荧光团， 从而实现更深组织成像具有重要意义. （2） 部分荧光染料的光稳定性较差， 如花菁类染料. 差的光稳定性会造成对成像结果的误断， 因此研发光稳定性高的荧光团也是目前的研究重点.

与纳米诊疗探针相比， 基于荧光成像的有机单分子诊疗探针具有制备和质控简单、 生物相容性好、 临床转化前景好以及分子结构易修饰等优势. 研发有机单分子诊疗探针通常采用偶联药物分子和荧光团的方式， 引入的连接子（Linker）可以对生物大分子响应（如二硫键对GSH响应）从而断开， 释放药物和荧光团， 此外通过引入可以猝灭荧光团的猝灭剂， 可以实现智能响应“点亮”型诊疗探针. 基于荧光成像的有机诊疗探针虽然具有较好的临床转化前景， 但仍旧存在以下问题亟待解决： （1） 荧光成像灵敏度较高， 往往只需要较低剂量便可以获得较好的成像效果， 而对于治疗来说， 比如化疗需要较高的剂量来维持杀伤肿瘤细胞的效果， 因此诊疗探针的给药剂量是一个需要考虑的问题. （2） 将抗癌药物与荧光团偶联后， 与单一的药物分子相比， 诊疗探针在生物体内的药物代谢行为可能会被改变， 药物疗效可能会受到影响， 如何保持药物在偶联前后的活性也是一个很重要的问题. （3） 目前诊疗探针的应用还处于探索过程， 具体如何利用诊疗探针解决临床难题需要研究者深入思考. 如， 传统铂类化疗药物具有副作用大、 易产生抗药性、 肿瘤组织蓄积少和分布不均匀等问题， 通过设计具有靶向作用的诊疗探针， 利用监测功能实时观察铂类药物在肿瘤和正常组织的代谢与分布情况， 从而调控化疗药物对正常组织的副作用和在肿瘤的蓄积与分布情况.

3 总结与展望

诊疗一体化探针的发展目前依旧处于前期研究阶段， 整合荧光成像和化疗功能于一个小分子上既充满挑战， 又令人向往. 在未来， 将荧光成像的窗口转移至近红外二区具有巨大临床转化的潜力.本文重点总结了部分近年来具有代表性的有机单分子荧光成像诊疗探针， 并将荧光成像又分为可见光成像、 近红外一区成像和近红外二区成像三部分进行阐述. 虽然有很多研究聚焦于可见光和近红外一区成像， 开发近红外二区成像的有机诊疗探针更有希望在临床上实现对病人癌症的诊疗. 相信在未来会有越来越多基于近红外二区成像的有机诊疗探针被开发出来， 从而为癌症的精准防治提供更多的选择.

作者

常通航1,3, 程震,1,2,3

1.中国科学院上海药物研究所分子影像中心, 新药研究国家重点实验室, 上海 201203

2.中科环渤海(烟台)药物高等研究院, 烟台新药创制山东省实验室, 烟台 264117

3.中国科学院大学, 北京 100049

参考文献 View Option

[1] Sung H.， Ferlay J.， Siegel R. L.， Laversanne M.， Soerjomataram I.， Jemal A.， Bray F.， CA： A Cancer J. Clin.， 2021， 71（3）， 209—249

[2] Kulik L.， El⁃Serag H. B.， Gastroenterology， 2019， 156（2）， 477—491

⭐️ ⭐️ ⭐️⭐️ ⭐️ ⭐️

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

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近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780−1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

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近红外二区小动物活体荧光成像系统

相机部分：

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

暗室及控制系统：

1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

⭐️ ⭐️ ⭐️ 应用案例⭐️⭐️ ⭐️

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

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【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

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通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm−2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

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特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

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临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

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缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

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【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

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利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

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【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

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近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

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细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

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准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

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NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

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纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

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⭐️ ⭐️ ⭐️ 案例结束⭐️⭐️ ⭐️

沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统， 性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

销售总监王总 电话/微信：177 1755 5513

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近红外二区小动物活体荧光成像系统