药物干扰对基于细胞的中和抗药物抗体（NAb）分析提出了很大的挑战。本研究旨在通过生物素-药物提取和酸解离法，以提高药物耐受性，开发出新的方法。此前，通过减少生物素药物浸出，提高Nab洗脱效率，已经可以改善酸化解离加生物素药物提取Nab的方案，使Nab的药物耐受性达到160μg/ml。
最近，为克服Nab酸洗脱效率低的问题，辉瑞团队基于开发了一种新的提升药物耐受的方法，结合了酸解离和靶向药物的捕获，获得了高达400μg/ml的药物耐受性。建立样品前处理方法选择和优化的策略流程，以提高NAb检测方法的药物耐受性。减少生物素-药物浸出和提高NAb洗脱效率是提高药物耐受性的关键。药物消耗（ drug depletion）是克服NAb洗脱效率低的一种替代方法。
免疫原性评估对于确定抗药物抗体（ADA）对患者安全性、药物疗效和药代动力学的影响至关重要。中和ADA（NAb）是ADA的一个子集，它能中和药物活性，降低药物疗效。如果药物存在内源性同源物，NAb可能抑制内源性同源物，可能导致临床虚证。因此，鉴定ADA的NAb活性是评估其免疫原性的关键步骤。NAb分析用于评估ADA抑制药物活性的能力。以细胞为基础的NAb检测方法能很好地反映药物的作用机制，因此在临床样品中检测NAb受到监管部门的青睐。与非细胞竞争结合法检测NAb相比，基于细胞的NAb检测灵敏度低，信号动态范围小。由于样品中存在过量的药物，严重干扰了NAb的检测，降低了检测灵敏度，因此开发适合目的细胞的NAb检测方法的挑战更加复杂。因此，在临床产品开发中，成功地进行样品预处理以去除样品中的过量药物，对于保证分析灵敏度和正确评估NAb事件至关重要。
利用抗体提取和酸解原理，采用亲和捕获洗脱法（ACE）、固相酸解萃取法（SPEAD）、沉淀酸解法和生物素药物酸解提取法（BEAD）等多种方法对提高ADA的耐药性具有重要意义。ACE法和SPEAD法在药物包被的96孔板上均能捕捉到ADA，与beads相比，其结合能力要小得多。沉淀-酸解法存在免疫球蛋白与PEG复合沉淀，样品在醋酸中重新包被在96孔板上，再检测ADA，不适用于NAb的测定。BEAD是在ACE和SPEAD基础上引入酸离解和beads形成的。由于基于细胞水平的NAb分析比ADA分析更容易受到样品前处理过程中残留药物水平和NAb回收率的影响，因此BEAD优于其他方法，被证明是提高NAb试验耐药性的有效方法。为了最大限度地提高NAb试验的药物耐受性，有必要进一步优化BEAD 法。
Bridging assay for determination of drug depletion efficiency
An MSD-based method（Meso Scale Discovery）was developed to measure NAb in samples with drug depletion treatment. Fifty microliter 0.25 μg /ml biotinylated drug per well was added to 4% BSA /PBST blocked streptavidin MSD plate, following by incubation for 2 h at RT. After plate wash with THST, 50 μl sample per well was added to the biotinylated drug bound MSD plate and incubated for 2 h at RT, followed by plate wash with THST. Then, the plate was
incubated with 50 μl of 0.125 μg /ml ruthenium labeled drug for 1 h at room temperature. Subsequently the plate
was washed with THST, 150 μl read buffer was added and the plate was read on MSD reader Sector Imager S600.（MSD 超敏多因子电化学发光分析仪：SQ120 & S600 ）
在第一个基于抗PD1细胞水平的NAb分析中，辉瑞团队提出了优化BEAD方法，该方法通过降低残留药物浓度，控制生物素化药物浸出，通过酸性缓冲液提高NAb洗脱效率。然而，在第二种基于抗TL1a细胞水平的NAb分析中，我们遇到了从药物中洗脱NAb的困难。为了避免NAb洗脱效率低的问题，开发了一种药物消耗（ drug depletion）替代方法，即通过酸离解中的靶向交联微球去除过量药物，从而显著提高药物耐受性。因此，辉瑞团队提出了一个选择合适的样品前处理方法和优化方法以提高检测药物耐受性的策略流程。
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